イヌ蛔虫は世界中に広く分布しているが、このことは本線虫卵が異なる気象（温）条件に対して広い許容範囲を有していることを示している。演者らはイヌ蛔虫1細胞卵は低温暴露に対して強い抵抗性を有し、4℃の条件下では全く発育することなく長期間にわたって生存し続けることを報告した（第78回日本寄生虫学会大会）。演者らはこの発育休眠現象をさらに追求すべく、温度条件以外にも本現象を誘導する条件について検討した。その結果、イヌ蛔虫1細胞卵をEscherichia coli などの細菌やSaccharomyces cerevisiaeなどの真菌、さらにはTrichomonas vaginalisなどの原虫の存在下で培養した場合、虫卵の発育が長期間にわたって全く認められなかったものの、この虫卵をさらに1%ホルマリンに懸濁し培養するとその後虫卵は正常に幼虫包蔵卵にまで発育したことなどから、これらの存在が虫卵の発育休眠現象を誘導することを明らかにした。次に演者らは本現象を誘導する因子を明らかにする目的でいくつかの実験を行った。その結果、イヌ蛔虫1細胞卵は曝気（酸素濃度が上昇）したこれら懸濁液で培養すると発育したこと、逆に低酸素濃度溶液で培養すると発育停止したことなどから、虫卵の発育休眠現象は酸素の欠乏により誘導されることが示唆された。

　イヌ蛔虫は世界中に広く分布しているが、このことは本線虫卵が異なる気象（温）条件に対して広い許容範囲を有していることを示している。演者らはイヌ蛔虫１細胞卵は低温暴露に対して高い抵抗性を有し、4℃の条件下では発育することなく長期間にわたって生存し続けることを報告した（第64回西日本支部大会）。今回この現象をさらに検討すべく、4℃で0 - 48週間静置後さらに発育至適温度（25℃）に移し2細胞卵に分割するまでの時間および虫卵の感染性を調べた。その結果、4℃で静置後の虫卵は静置していない虫卵とほぼ同様の時間 (21 - 22 時間) で2細胞卵に分割し、マウスに対する感染性も確認できた。これらのことより、イヌ蛔虫1細胞卵の4℃での静置は虫卵の発育を全く開始させないこと、その後の発育に何ら影響を与えないことなどが明らかになった。つまり虫卵の長期保存を可能にすることが明らかになった。さらにイヌ蛔虫卵は大腸菌などの細菌の存在下で培養した場合、その発育が全く認められなかった。そこでこの現象をさらに追求すべく、以下の検討を行った。第一に、虫卵をグラム染色または運動性など性質が異なる5種類の細菌の存在下で培養した結果、全ての組み合せにおいて虫卵の発育停止現象が認められた。第二に、大腸菌を24時間培養したハートインフュジョンブイヨン培地を濾過滅菌することによって菌体を取り除いた懸濁液で虫卵を培養した結果、発育が認められた。これらのことより、本現象は大腸菌に特異的なものではなく細菌全般に共通して認められるものであること、細菌由来の分泌物などではなく菌体自体の存在が強く影響していることなどが示唆された。

　Centrocestus armatus は異形吸虫科に属する腸管内寄生虫であり、カワニナを第1中間宿主、カワムツなどの淡水魚を第2中間宿主、そしてヒトを含む鳥類やほ乳類を終宿主とする小吸虫である。我々は本吸虫の流行地における感染動態を明らかにする目的で、本吸虫のセルカリアの河川水からの回収方法を検討するとともに、開発した方法を用いて季節内変動および日内変動とその要因に関して検討した。河川水からのセルカリアの回収に際しては、ろ過装置に装着した30μmのプランクトンネットでセルカリアをろ過し、0.1%のアクリジンオレンジで染色後、実体顕微鏡下で観察する方法を開発した。実験室内で行った予備実験の結果、1 Lの水道水中に含まれるセルカリアの回収率は97-100%であった。この方法を用いて河川水から検出されるセルカリア数の季節的変化を調べたところ、温度の高い夏場には多くのセルカリアが認められるものの、冬場には全く認められなかった。夏場の河川水30 Lのセルカリア数を2時間ごとに24時間調べたところ、その数は午前8時から上昇し始め午後4時にピークになったあと、以後漸次減少するという一峰性のピークを示した。午後10時から午前6時までのセルカリア数は少なく、これを午後4時のピーク時と比較すると、13分の1と低い値であった。そこで我々はこの変化が日の出や日の入り (照度変化) とも関係していたこと、さらには気温や水温の変化 (温度変化)とほぼ類似していたことより、光の多少あるいは温度がセルカリアの遊出に関係するのではないかと考え、実験室内で数種の実験を検討したところ、夏場の明条件では暗条件の7倍のセルカリアが確認でき、セルカリア数の日内変動には光が影響していることが明らかとなった。また、セルカリア数の増減は水温の変化とよく一致していたことより、水温も影響していることが明らかとなった。

　ホルマリン・エーテル（MGL）法はRitchieによって1948年に報告された寄生虫卵検出のための糞便検査法である。この方法では各種蠕虫卵のみならず原虫のシストも検出可能であることから、最も信頼性のある糞便検査法の1つとして現在でも広く用いられている。しかし一方、演者らが蛔虫受精卵を用いて再検討したところ、その虫卵回収率はわずか35%前後であり、集卵は不十分であったことを先の大会で報告した。今回演者らは、糞便懸濁液の種類やpH、検査に供する糞便量、糞便懸濁液の濾過方法および洗浄法、さらには得られたプラグの再濾過を検討し、これを単位沈渣量あたりの回収虫卵数、すなわち指数を用いて評価した。その結果、1.5 gの糞便およびpH 3に調整したホルマリン液を用いてMGL法を行った場合、3枚のガーゼを用いて糞便懸濁液を濾過し、さらに5 mlのホルマリン液でガーゼを洗浄することで沈渣量を減少させ、かつその指数を従来の値より増加させることが可能となった。現在、寄生虫感染流行地のヒトの糞便を用いて、従来法と改良法との比較検討を行っている。

　糞線虫の宿主への感染はフィラリア型幼虫の経皮感染によって成立する。そこで演者らは過去にArakiら(1986)が広東住血線虫の組織侵入性を評価するのに用いたin vitro実験法を修正し、糞線虫の感染モデルであるネズミ糞線虫の皮膚侵入能の評価を試みた。具体的には注射筒の先端に装置した動物の皮膚に侵入あるいは貫通するネズミ糞線虫の幼虫の数を定量化する方法である。今回この方法を用いて異なる条件下での侵入率の違いを比較した。それによるとin vitroで発育させた第3期幼虫とその終宿主であるラットの腹部の皮膚の組み合わせの場合、平均で88％の侵入が認められた。この現象は37℃で確認されたが、15℃では17％と極端に侵入率が低下した。この方法を用いれば幼虫の感染能獲得時期、あるいは動物種による侵入率の違い等の評価が可能となるために宿主寄生体相互関係の解明に貢献し得るものと考えられる。今大会ではこれらに関する検討を行うとともに、第3期幼虫の皮膚侵入時の走査型電子顕微鏡による観察も行ったので併せて報告する。

　イヌ蛔虫は世界中に広く分布しているが、このことは本線虫卵が異なる気象（温度）条件に対して広い許容範囲を有していることを示している。そこで我々は温度に着目して、子宮から回収した虫卵を-13℃から37℃の任意の温度で異なる期間培養し、その発育状況を観察した。子宮から回収した虫卵を25℃で2週間培養した場合、その90%前後が幼虫包蔵卵にまで発育した。これに対し、37℃で培養した場合、正常に幼虫包蔵卵にまで発育する虫卵はほとんど認められず、37℃の条件下では虫卵に致死的に作用することが明らかとなった。また虫卵を-13℃あるいは4℃で培養した場合、虫卵の発育は全く認められなかったが、その後虫卵を25℃に移しさらに培養したところ、その90%前後が幼虫包蔵卵にまで発育した。この現象は、虫卵を4℃で6ヵ月間静置した場合にも同様に認められた。子宮から回収した虫卵を25℃で24時間培養した場合、そのほとんどが2細胞卵にまで発育した。これに対し、陰門を接着剤で塞ぎ産卵できないようにした雌成虫を同じ条件で培養した場合、子宮内の虫卵の発育は全く認められず、子宮内には虫卵の発育を抑制する何らかの因子が存在することが明らかとなった。現在我々は、培養条件を変化させて、虫卵の発育に影響する温度以外の因子に関しても検討を行っている。

　Centrocestus armatus is an intestinal parasite belonging to the family Heterophyidae. For this parasite, the first intermediate host is a fresh water snail, Semisulcospira sp., the second intermediate host is a fresh water fish, Zacco temminkii, and the final hosts are birds and mammals, including humans. We developed an apparatus for recovering cercariae and clarified the infection dynamics of this parasite. In addition, we investigated the daily and seasonal changes of cercarial emergence together with the factors affecting cercarial shedding. Cercariae in river water were recovered using a nylon plankton net (pore size, 30 μm) installed in the apparatus, stained with 0.1% acridine orange and observed under a stereoscopic microscope. The recovery efficiency of cercariae suspended in 1 L of tap water was 97-100%. When we applied this apparatus to river water in an endemic area, about 200 cercariae were contained in 1 L of river water during the summer season, while no cercariae were found during the winter season. To clarify the circadian rhythm of cercarial shedding in the summer season, we examined river water every 2 hours for 24 hours. Cercariae began to be detected between 06:00 and 08:00, increased over time to reach a peak at 16:00 and decreased thereafter, thus showing a one-peak pattern. The mean number of cercariae detected between 22:00 and 06:00 was 17, which was equivalent to 1/13 of the number during daytime (7.2 cercariae per 1 L of water). This cercarial shedding pattern appeared to be related to sunrise/sunset (brightness change) and water/atmosphere temperature (temperature change). Therefore, we examined whether cercarial shedding was affected by light or temperature changes under laboratory conditions and confirmed that both brightness and temperature were important factors for cercarial shedding.

　The formalin-ether sedimentation (MGL) technique, which was first introduced by Ritchie in 1948, is a well-known fecal examination technique. The MGL technique can detect both helminth eggs and protozoan cysts simultaneously. Therefore, it has been considered to be one of the most reliable techniques for fecal examination. However, some reports have mentioned that the recovery efficiency of this technique is only 6-49%. Two reasons were proposed for the low recovery efficiency. First, the intensity of the parasitic infection decreases (EPG decreases) as the sanitary conditions in endemic areas are improved, and this effects creates more false-negative results than in the past. Second, the character of feces has changed because we currently take much more fat and/or animal protein compared with 60 years ago. One of the authors clarified the low recovery efficiency of the MGL technique. Based on the above-described proposals, we decided to reevaluate the recovery efficiency of the original MGL technique. Among the Ascaris lumbricoides fertilized eggs used for preliminary experiments of the original MGL technique, 2% were recovered from the inside of the tube, 27% from the gauze and 36% from the scum, such that only 35% were recovered from the plug. These results clearly show that the recovery efficiency of the original MGL technique is insufficient. To improve these results, we examined the optimum pH of the fecal suspension, amount of feces used, filtration and washing of the gauze (pre-treatment), and re-filtration of the plug (post-treatment). As a result, use of 1.5 g of feces instead of 0.5 g was effective for increasing the number of eggs recovered and pre-treatment using three layers of gauze instead of one layer was effective for decreasing the sediment. Furthermore, post-treatment was effective for further decreasing the sediment, and the reduced amounts of contaminants made microscopic examination easier. Further investigations into improvement of egg recovery are still required.

　Toxocara canis, a common intestinal nematode of dogs, is the parasite responsible for zoonoses. T. canis is distributed worldwide, suggesting that T. canis eggs are capable of surviving under various weather conditions, particularly different temperatures. This study focused on the effects of temperature and related factors on the development of T. canis eggs. 　Adult T. canis females or eggs recovered from them were cultured at -13, 4, 25 or 37℃ for appropriate periods, before being shifted to 25℃ and examined for subsequent development of the eggs. The eggs cultured at 25℃ developed quickly and approximately 90% of them developed into the embryonated egg stage within 2 weeks. In contrast, the eggs cultured at 4 or -13℃ showed no development, irrespective of the culture period. However, approximately 90% of these eggs developed into the embryonated egg stage after being shifted to 25℃, indicating that the eggs kept at low temperatures remained viable. When one-cell, multicellular and embryonated eggs were cultured at -13℃, approximately 90% of the one-cell survived, compared to only approximately 40% of the multicellular eggs. These findings indicate that the resistance of T. canis eggs to temperature alters according to the developmental stage. When the eggs were cultured at 37℃ for 24 hours, most of them developed into the multicellular egg stage. On the other hand, when adult T. canis females, which were unable to lay eggs due to closure of the vulva with an adhesion bond, were cultured under the same condition, the intra-uterine eggs showed no development, indicating the existence of factors that inhibit the development of eggs. Currently, we are studying effects of various factors on the development of T. canis eggs by changing the culture conditions.

　Diagnosis of larva migrans has mainly performed by immunodiagnostic methods. However, the results obtained from these methods simply show the presence or absence of antibodies and do not reveal active infection of the patients. Among the causative agents of larva migrans, T. canis is considered to be one of the most important parasites. Therefore, we aimed to establish a diagnostic method for detecting T. canis circulating antigen using a sandwich ELISA. For the sandwich ELISA, we sensitized a monoclonal antibody, reacted it with a test sample and then applied a commercially available enzyme-conjugated antibody. Monoclonal antibodies were produced against the excretory-secretory (ES) antigen of second-stage larvae of T. canis. Among the monoclonal antibodies obtained, we selected one monoclonal antibody (TCMAB12; molecular weight, 30-80 kDa, IgG) for use in the sandwich ELISA. We established the cutoff value of the present method to be 0.295, representing the mean + 2 standard deviations (probability level of more than 95%). Accordingly, in the present experiments, optical density values of more than 0.295 were regarded as positive. The cross-reactivity of the sandwich ELISA against thirteen different kinds of parasite antigens (twelve nematoda antigens and one trematoda antigen) were examined. The results revealed that the antibody reacted with T. canis ES antigen, T. canis female antigen and T. canis second-stage larvae antigen, but did not react with any other antigens. From results obtained using an ES antigen concentration standard curve, we confirmed that the detection limit of the sandwich ELISA was 5 ng/ml, which provides sufficient sensitivity for a diagnosis of toxocariasis. We applied the method to suspected toxocariasis patients and examined the circulating antigen in their sera. Specifically, we used nine serum samples collected from patients with suspected toxocariasis based on both their clinical symptoms and high antibody titers. Overall, five sera showed antigen-positive reactions (mean absorbance, 0.543), while the remaining four sera showed antigen-negative reactions (mean absorbance, 0.225). These results indicated that about 44% of the antibody-positive patients were antigen-negative, not ongoing active infection. The results obtained using this technique would provide us with new viewpoints for understanding toxocariasis.

　演者らは異形吸虫科の腸管寄生性小吸虫であるCentrocestus armatus の流行動態を明らかにする目的で、第63回日本寄生虫学会西日本支部大会において、兵庫県千種川における本吸虫のセルカリア数の日内変動を報告した。我々はその後も調査を続行中であるので得られた結果を併せて報告する。すなわち、本吸虫の流行地の夏場の河川水30 L中のセルカリア数を2時間毎に24時間に渡って調べるという方法でセルカリア数の変化を調べたところ、その数は午前6時から上昇し始め午後4時にピークになったあと、以後漸次減少するという一峰性のピークを示した。午後10時から午前6時までのセルカリア数は平均17匹と少なく、これを午後4時のピーク時の217匹と比較すると、13分の１と低い値であった。さらにセルカリアの比重は1.25以上であったが、河川水の上層、中層、あるいは下層部のセルカリア密度に変化は認められなかった。そこで我々はこの変化が気温や水温の変化（温度変化）とほぼ類似していたこと、さらには日の出や日の入り（照度変化）とも関係していたことより、温度あるいは光の多少がセルカリアの放出に関係するのではないかと考えた。現在演者らは、冬場の河川水についても同様の調査を行い検出されるセルカリア数と日内変動の有無を調べるとともに、それら変化の要因とセルカリア遊出との関係を明らかにするための数種の実験を検討中である。

　ホルマリン・エーテル（MGL）法はRitchieによって 1948年に報告された糞便検査法であり、現在ではもっとも信頼性のある寄生虫検査法の1つと考えられている。しかし近年、寄生虫の感染強度の低下や現代人の糞便の性状変化などのため、かつてのMGL法では十分な回収率が得られず、寄生虫の有病率が低く見積もられることが危惧される。そこで演者らは、寄生虫の正確な侵淫実態を明らかにするために、MGL法の改良を試みた。演者らはすでに第63回日本寄生虫学会西日本支部大会において、回虫受精卵を用いたMGL法の各手順を再検討した結果、計算上求められる総虫卵数の2％が試験管に、27％がガーゼに、そして36％がスカムに補足され、沈渣には用いた虫卵のわずか35％しか回収されないことを明らかにした。さらに、これを改善するために50 mlの試験管を用いてMGL法を行った結果、(1) 30 mlのホルマリン液でガーゼを洗浄することが可能になり、ろ過過程で消失する虫卵の割合が62％から19％と有意に減少したこと、 (2) 従来法の10 mlの試験管を用いたときに比べスカム厚が1/3以下に減衰し、虫卵回収数が2倍以上になったこと、等を示した。しかし、50 mlの試験管を用い、ガーゼ洗浄の操作を加えてMGL法を行った場合、最終的な虫卵回収数は増加したものの、沈渣単位あたりの虫卵回収数は改善されていなかった。そこで演者らは、虫卵回収率を改善するためには、沈渣量および侠雑物をできる限り少なくし、かつ回収される虫卵数を多くすることが更なる課題であると考え、現在過去のデータを含めた再検討を行っている。

　糞線虫の宿主への感染はフィラリア型幼虫の経皮感染によって成立する。演者らは第63回日本寄生虫学会西日本支部大会において過去にAraki ら（1986）が広東住血線虫を用いて報告したin vitro実験法を修正し、この方法でネズミ糞線虫第3期幼虫の皮膚侵入能も評価できることを報告した。今回我々はこの実験法を用い、幼虫懸濁液とラットの皮膚との接触時間を変化させることにより、ネズミ糞線虫第3期幼虫の侵入にかかる時間の検討を行った。その結果、ネズミ糞線虫の宿主への侵入は10分後の時点で既に70−80％と、60分後のそれと比較した場合とほぼ同程度の侵入率であることが明らかとなった。これはネズミ糞線虫と同属のヴェネズエラ糞線虫の場合、10分間で70−80%の侵入が起こるというMaruyamaら（2005）の報告とも一致しており、ネズミ糞線虫においても侵入は比較的短期間に起こっている事が示唆された。現在我々は、侵入に要するこの時間をさらに詳細に検討すべく、時間を短縮した実験を行っている。一方、温度が幼虫の皮膚侵入能に影響する。すなわち37℃では84％の幼虫が皮膚に侵入したのに対して、15℃での侵入率はわずか20％程度であり顕著に侵入率の低下が認められた。現在さらに詳細に温度の影響を把握するべく、条件を変えていくつかの検討を行っている。

　Centrocestus armatus は異形吸虫科に属する腸管内寄生虫であり、カワニナを第1中間宿主、カワムツなどの淡水魚を第2中間宿主、そしてヒトを含む鳥類やほ乳類といった広い範囲の終宿主を有している。演者らは本吸虫の感染動態を明らかにする目的で、流行地の河川水からのセルカリアの回収方法を検討した。セルカリアはろ過装置 (Advantec, KS-142; Tokyo) に装着した30μmのプランクトンネットでろ過し、3%のホルマリン液で固定、0.1%のアクリジンオレンジで染色後、実体顕微鏡下で観察する方法でよく回収できた。実験室内で行った予備実験の結果、1 Lの水道水中に含まれるセルカリアの回収率は97-100%であった。そこでこの方法を用い、本吸虫流行地の河川水30 L中のC. armatusセルカリア数を調べたところ、若干の夾雑物が認められたものの46-66匹が検出された。現在、この方法を用いて流行地の河川に存在するセルカリアの数を2時間毎に調べてその日内変動を調査しているので、これらの結果も併せて報告する。

　The attachment and penetration of Centrocestus armatus cercariae into gill tissues of their fish hosts, Zacco temmincki, were described using light and electron microscopy, histology, and histochemistry. The surface topography of C. armatus cercariae was described and contributed to the understanding of gill attachment and penetration. It has a well-developed and highly protractible anterior penetration apparatus and a spined body concave ventrally with a unique suction-like apparatus. The behavior patterns of C. armatus cercariae differed from those known from Schistosoma and Diplostomum species. After their attachment to gill filaments the cercariae shed their tail and performed a short period of leech-like creeping behavior before they started penetration movements. All penetration sites were through the surface of gill primary lamellae leading to the central venous sinus. Scanning electron microscopy showed that the body of the tail-less larva was divided into two distinct regions, the non-contractile anterior region levering to gill tissues by its hooklets, and the highly contractile body region creating a driving force for penetration. The larva had completed penetration within a mean of 5 minutes, the fastest full penetration occurred in 58 seconds. Transmission electron microscopy and histochemistry revealed glandular secretions released to the surface tegument upon attachment to gills. The presence of penetrating cercariae also increased the respiratory frequency rate and mucous production of the fish hosts. This may simply be a stress-related response by the fish hosts to cercariae but this condition would provide more opportunities for entrance and attachment, resulting in greater infection success.

　従来からホルマリン・エーテル法は高い回収率を有しており信頼性が高いと考えられてきた。しかし、佐藤・宇賀（2003年）は第59回本大会において、遠心沈殿法による集卵が必ずしも十分ではないことを報告したが、従来法と彼らの方法との回収率を比較した結果、両者の間に差を見つける事は出来ていない。そこで今回我々は、回虫受精卵を用いてホルマリン・エーテル法の各手順を再検討した。本法を常法に従って行った結果、計算上求められる総虫卵数の2％が試験管壁に、27％がガーゼに、36％がスカムに、そして35％が沈渣に分布していた。最終的に得られる沈渣は140?lであり、観察にはその25?lを用いるため、観察できる虫卵数は全体の6％でしかなかった。この値は直接塗抹法で得られた虫卵数の1.1倍にしか相当せず、集卵が不十分であることを示していた。これを改善する手段として我々は、スカム中に捕捉される虫卵数を減少させることが回収率の向上に最も効果的であろうと考えた。そこで、分散剤として知られるゼラチンで前処置した場合や、試験管の直径を変えた場合の回収率を検討した。その結果、前者ではスカム量に変化が見られなかったものの、試験管の直径の増加に従ってスカムの厚さが薄くなり、そこに含まれる虫卵数が減少する傾向を認めた。現在さらに、ろ過法や糞便の前処置による回収率の向上を検討している。

　糞線虫の宿主への感染はフィラリア型幼虫の経皮感染によって成立する。そこで演者らは過去にArakiら(1986)が広東住血線虫の組織侵入性を評価するのに用いたin vitro実験法を修正し、糞線虫の感染モデルであるネズミ糞線虫の皮膚侵入能の評価を試みた。具体的には注射筒の先端に装置した動物の皮膚に侵入あるいは貫通するネズミ糞線虫の幼虫の数を定量化する方法である。今回この方法を用いて異なる条件下での侵入率の違いを比較した。それによるとin vitroで発育させた第3期幼虫とその終宿主であるラットの腹部の皮膚の組み合わせの場合、平均で88％の侵入が認められた。この現象は37℃で確認されたが、15℃では17％と極端に侵入率が低下した。この方法を用いれば幼虫の感染能獲得時期、あるいは動物種による侵入率の違い等の評価が可能となるために宿主寄生体相互関係の解明に貢献し得るものと考えられる。今大会ではこれらに関する検討を行うとともに、第3期幼虫の皮膚侵入時の走査型電子顕微鏡による観察も行ったので併せて報告する。

　幼虫移行症の診断は主に免疫学的な方法を用いて行われているが、抗体を検出して診断する方法は必ずしも現在進行中の感染を示すものではない。そこで我々は幼虫移行症のなかでも特に犬回虫症の免疫学的診断のためにサンドイッチELISAを行って循環抗原検出を試みた。その方法に用いる抗体は特異性を高めるために第2期幼虫を培養して得た排泄・分泌（ES）抗原から作製したモノクローナル抗体を用いた。そのモノクローナル抗体の内IgG 1の抗体（TCMAB 12）の分子量は80、 50、および30 kDaであった。また交差反応は犬回虫雌雄、第2期幼虫、幼虫包蔵卵、猫回虫雄雌、豚回虫、犬糸状虫、旋毛虫被嚢幼虫、広東住血線虫およびCentrocestusのメタセルカリアのそれぞれ可溶性抗原を用いて反応を検討したところ、イヌ回虫雌と第2期幼虫の抗原に反応した。このモノクローナル抗体を用いてサンドイッチELISAの検討を行ないES抗原の検出を試みた。カットオフ値は陰性検体の＋2 SD以上とし吸光度0.295以上を陽性とした。ES抗原の検出可能な濃度は5 ng/mlであり、血流中の循環抗原を充分に検出できると考えた。

　The attachment and penetration of Centrocestus armatus cercariae into gill tissues of their fish hosts, Zacco temmincki, were described using electron microscopy, histology, histochemistry and light microscopy. The surface topography of C. armatus cercariae was described and contributed to the understanding of gill attachment and penetration. It has a well-developed and highly protractible anterior penetration apparatus and a spined body concave ventrally with a unique suction-like apparatus. The behavior patterns of C. armatus cercariae differed from those known from Schistosoma and Diplostomum species. After their attachment to gill filaments the cercariae shed their tail and performed a short period of leech-like creeping behavior before they started penetration movements. All penetration sites were through the surface of gill primary lamellae leading to the central venous sinus. Scanning electron microscopy showed that the body of the tail-less larva was divided into two distinct regions, the non-contractile anterior region levering to gill tissues by its hooklets, and the highly contractile body region creating a driving force for penetration. Transmission electron microscopy and histochemistry revealed glandular secretions released upon entrance to gill chambers, which aided attachment and penetration processes. It was often observed two cercariae creeping on the same site in the process of penetration. The presence of penetrating cercariae also increased the respiratory frequency rate and mucous production of the fish hosts. This may simply be a stress-related response by the fish hosts to cercariae but this condition would provide more opportunities for entrance and attachment, resulting in greater infection success.

　There are many developing countries where more than 50% of the inhabitants are being infected with parasites. In addition to low personal hygiene and public health conditions in these countries, various factors may exist that inhabitant get infection of parasites. We carried out the formal-ether sedimentation method for 473 primary school students in one commune of Bac Giang Province, Hiep Hoa District, Vietnam, in October 2005, and examined the parasitic fauna. Simultaneously, we performed the questionnaire survey to clarify the relationship between parasitic infection and its related factors which may affect to infection. 　Of the 473 students involved in the study, 261 (55%) were positive for parasites.These parasites and their infection rates were Ascaris lumbricoides (45%), Trichuris trichiura (20%), hookworm (3%), Enterobius vermicularis (2%), Giardia intestinalis (1%), Hymenolepis diminuta (0%), Fasciolidae (2%), and Opisthorchiidae (2%). Of the eight genus and eight species of parasites detected, high infection rates of A. lumbricoides and T. trichiura were remarkable. To clarify the relationship between parasitic infection and the student’s or their parent’s life styles, a questionnaire survey was conducted. The questionnaire included 20 questions regarding the students’ body height, weight, and school records and parent’s educational background, income, and occupation etc. For analysis of the survey results, students who showed more than 2,000 EPG for A. lumbricoides or more than 600 EPG for T. trichiura were selected as high positive and compared with parasite-negative students.
　As a result, body weight, height, family size, habit of washing hands before meal or after defecation, and health educations did not show any positive relation with parasite infection. In contrast, the students who had well educated or high-income parents showed lower infection rate of parasite than those who had not such parents.

　This study established the mechanism by which Centrocestus armatus cercariae locate, attach and penetrate the second intermediate fish hosts, Zacco temmincki. Light and scanning electron microscopy were used to investigate cercariae feature and to follow its fate when released in close proximity to the fish host. The cercariae of C. armatus was concave ventrally and with simple pointed spines all over its body. The penetration apparatus was provided with nine large preoral hooklets, arranged alternatively in two rows. Six sensory papillae surround the small oral aperture, four located ventrally and two antero-laterally. It was shown that cercariae were carried through respiratory currents into the fish gills (81%), instead of actively invading the skin or other surface tissues of the fish hosts. The cercariae shed their tails upon contact to gill tissues and tend to align parallel on gill filaments. The observed presence of mucous coat in cercariae seemed to play an important role for attachment. The body of the now tail-less larva exhibited considerable contractility changing from a roughly circular to a narrow elongated form, while the anterior oral region was distinctly separated by a fissure and was highly protractible. Behavior during penetration appeared to be much like an inchworm movement where the anterior region is levered while using their hooklets to pierce through the holes into underlying channels in the gills. This study is still on its preliminary stage and further investigations are yet to be done and will be reported accordingly.

　ラオスの下痢症患者を対象として、原虫感染の実態を把握することを目的に、2002年2月より2005年1月まで首都ビエンチャン市内とその近郊の6病院、およびタケーク市内の２病院の下痢症患者合計1290検体（それぞれ686検体、604検体）の調査を実施した。採取された下痢便検体は、Cryptosporidiumの検査にはショ糖浮遊法後の検体を位相差顕微鏡で、その他の原虫類の検査には落射蛍光顕微鏡および微分干渉顕微鏡を用いた直接検鏡法で検査した。調査の結果、ビエンチャン市では6.0％、タケーク市では16.1％の割合で合計5属5種の原虫類が検出された。それらの種類ならびにビエンチャン市とタケーク市における寄生率はGiardia intestinalis (2.5％, 5.0%), Cryptosporidium (0.4％、0.2%), Cyclospora cayetanensis (0.1％、2.0％), Isospora belli (0.1％、0％), およびSarcocystis sp. (2.3％、8.9％)であった。検出された原虫類のうち最優占種はSarcocystis sp.であり、次いでG. intestinalisであった。また、地域的にはビエンチャン市よりタケーク市の陽性率が高かったが、性別、年齢層、あるいは季節による陽性率の差は認められなかった。今回の調査ではSarcocystis sp.が多く検出され、近隣諸国における結果とは異なる原虫相を呈していた。

　Cyclospora cayetanensis はヒトを固有宿主とするコクシジウム目の原虫であり、ヒトに経口感染して下痢の原因となる。ネパールで1993年に旅行者と居住者からC. cayetanensisが最初に分離されて以来その分布は知られているが、その正確な侵淫実態は必ずしも明らかにされていない。一方、ラオスでは本原虫に関する報告は全く行われていない。そこで演者らはこれら両国から集めた2,083検体の下痢便を対象としてC. cayetanensis感染の疫学調査を実施した。検査方法は採取した下痢便を等量の2％重クロム酸カリウム溶液で溶解し、その10μlを落射蛍光顕微鏡と微分干渉装置を用いて直接観察する方法である。
　ネパールにおけるC. cayetanensisの陽性率は全体で9.2％（128/1,397）であった。季節別では高温・多雨の夏季（6月〜8月）における陽性率（12.6％）が、他の3季節におけるそれを有意（P＜0.05）に上回っていた。患者の発生状況をカトマンズ盆地内とその外で比較したところ、前者の陽性率が後者のそれを上回って（P＜0.05）いた。これに対してラオスでは調査した686検体のうちC. cayetanensisが検出されたのは4歳の少年からの1例のみ（0.1％：1/686）であった。
　ネパールでの結果とは対照的に、ラオスでは1例の陽性しか得られなかったその理由については明らかではないが、ラオスにおいてもネパール同様雨季は存在し季節条件の差異は否定できるため、スラム化等による人口密集といった人為的な環境要因がその理由ではないかと考えた。

　The infection dynamics of Centrocestus armatus cercariae to second intermediate fish hosts were investigated using cercariae collected from naturally infected Semisulcospira libertina. Cercariae survival and infectivity to juvenile minnow were recorded at 2-hr intervals. Survival remained constant but decreased abruptly at 30 h of age. An age-dependent model presented the best-fit curve for the survival data and implied that cercariae tended to allocate resources equally among themselves and then died once these resources were depleted. Cercariae infectivity initially remained constant over the first 10 hr of life and then declined; an age-dependent model also provided a better fit. The transmission rate of C. armatus cercariae to the fish host was relatively slow near the time of emergence from the snail host but peaked at 85% from 1 hr and then maintained a plateau period until 5 hr of exposure to fish. The pattern of transmission was also investigated, first at varying densities of cercariae and second, by maintaining a constant cercariae density, but varying the total number. Results revealed that the pattern of transmission was frequency-dependent. The transmission route of cercariae was via the gills (81%); moreover, cercariae could locate and attach even to other incompatible freshwater fish species being investigated. Thus, the mode of infection of C. armatus cercariae to second intermediate fish hosts was found to be passive and non-specific.

　Diagnosis of larval migrans is usually done by immunodiagnostic methods. These methods, however, simply show the presence of antibody but not the active infection of the patients. In addition, these could not reveal the actual prevalence of the disease. In this study, we investigated monoclonal antibody production against Toxocara canis and the fundamental conditions of sandwich ELISA technique for antigen detection in humans. BALB/c mice were immunized using suspension of equal volumes of excretory-secretory antigen of Toxocara canis and Freud`s complete adjuvant. Immunization was done intraperitoneally at two-week　intervals and then followed by a booster three days after the second immunization. After confirmation of the rise of antibody titer by ELISA, the mice were sacrificed and their spleen cells recovered. The spleen cells were fused with myeloma cells (P3UI) in vitro. Antibody producing hybrid cells were cloned by limited dilution method and allowed to produce monoclonal antibody. The isotypes of monoclonal antibody obtained was identified using commercially available immunoglobulin isotyping kit (Wako). Five clones were isolated and identified as one　clone of IgM and four clones of IgG1. Of the four IgG1 clones, one (TCMAB12) was found to be non cross-reactive with both sexes of Toxocara canis and Ascaris suum adult, Dirofilaria immitis adult, Trichostrongylus orientalis adult, encysted larvae of Trichinella spiralis, and metacercariae of Centrocestus armatus. Currently, we are investigating the fundamental condition for sandwich ELISA to detect circulating antigen in human serum.

　Larval development in the genus Strongyloides is known to be greatly affected by a variety of environmental factors to which larvae are exposed outside the host. This investigation focuses on the effect of temperature on Strongyloides ratti. Low temperature (15℃) was shown to favor direct development, producing infective larvae, while high temperature (25℃) favored indirect development, producing free-living females and males. Subsequent development of larvae was determined by a 16-h temperature stimulus at 15℃ or a 6-h temperature stimulus at 25℃. Moreover, eggs were not susceptible to a cold-temperature stimulus at 15℃, while newly-hatched larvae were. The results indicate that the developmental course of Strongyloides ratti larvae outside the host is determined at a relatively early stage before the first molt and that they become susceptible to ambient temperature just after hatching.

　我々はヒトに幼虫移行症をおこす犬回虫症の血清学的診断のためにモノクローナル抗体の作製を試みている。その目的のために、現在Toxocara canis の第2期幼虫の排泄・分泌（ES）抗原の作製を行っており、（1）T. canis 卵の培養、（2）幼虫包蔵卵の人工孵化、および(3)得られた第2期幼虫の精製を試みた。T. canis 卵の培養に関しては、培養温度および培養液の種類を変化させて検討した結果、25℃での培養条件が最適であったのに対して、培養液の違いによる発育率に大きな差異は見られなかった。幼虫包蔵卵の人工孵化については、マグネチック・スターラーとガラスビーズを組み合わせ物理的刺激を与え孵化させる方法と、ガラス製ホモジナイザーを用いて孵化させる方法でその孵化率を比較検討したところ、後者が前者を上回っていることが確認できた。このようにして得られた第2期幼虫は濾紙（Whatman）、キムワイプ(クレシア)、およびCell Strainer （FALCON）をもちいて濾過し、幼虫の精製を試みた。濾紙を用いた場合はほとんどなにも濾過されず、キムワイプを用いた場合は幼虫のみならず、幼虫や虫卵の断片が多数混入していた。40 mmのCell Strainerを用いて濾過したところ、ほぼ純粋な第2期幼虫を得ることが出来た。今後、この幼虫を用いてES抗原の作製作業を進めていく予定である

　我々は第74回日本寄生虫学会大会において旋毛虫（Trichinella nativa）の被嚢幼虫を用いた凍結実験を行った結果、界面活性剤で処理し、グリセリンを25%の割合に用い、かつ１℃/minの速度で凍結した場合、84%の生存虫体が得られたにもかかわらず感染性は認められなかったことを報告した。我々はその理由を、耐凍剤が虫体に十分に浸透していないため、虫体内部の保護が充分でなく、内臓が破壊されたのではないかと考えた。Gegan and James (1988) は胆汁処理が虫体表面の浸透性を増やすと報告している。そこで、我々は被嚢幼虫をイヌの胆汁で処理し、グリセリンを25%の割合に用いとともに、平衡時間を37℃で3時間行った後、１℃/minの速度で凍結するという方法を検討した。その結果、89％の生存虫体が得られたため、これらの2,000匹をマウスに経口的に感染させたが感染性は認められなかった。そこで、同様に処理した虫体を直接マウスの小腸に入れるという手法を用いて感染実験を行った結果、低率ではあるが感染性が認められた。現在、我々は被嚢幼虫より身体の構造が簡単な新生幼虫を用いて凍結実験を行っている。新生幼虫の凍結に関して、耐凍剤の種類や平衡時間を検討し、感染実験も行っているので、本大会では得られた結果を報告する。

　ネズミ糞線虫の幼虫は外界で発育する際に暴露される様々な環境因子によってその将来の発育に大きく影響を受けることが知られている。その因子の1つとされている培養温度について検討したところ、高温刺激（25℃）を与えると間接発育を、そして低温刺激（15℃）を与えると直接発育をする虫体が増加するという相反する現象が観察された。そこで、我々は培養温度を用いて、（1）刺激の持続時間と幼虫の発育方向が決定される時期との関係を明らかにするとともに、（2）幼虫が培養温度に対して感受性を示し始める時期を明らかにすることを目的として以下の検討を行った。その結果、高温刺激の場合はわずか6時間、また低温刺激の場合は8時間でその影響がその後の虫体の発育を決定することが明らかとなった。次に、幼虫孵化後に充分な時間の低温刺激を与えた後、高温刺激を与えた場合ではほとんどの虫体が直接発育をした。これに対して、幼虫孵化前に充分な時間の低温刺激を与えて同様に高温刺激を与えた場合には直接発育ではなく間接発育をする虫体の割合が増加した。これらのことより、ネズミ糞線虫の幼虫は糞便排泄後6-8時間の比較的早期に直接あるいは間接発育の決定が行われており、その環境因子の影響に対しては孵化後から感受性を示し始めることが強く示唆された。

　Epidemiology of Centrocestus armatus in Hyogo Prefecture has been conducted since 2002 and has revealed that the mean prevalence rates to first and second intermediate hosts were 39 and 100%, respectively. Throughout the survey we have found that metacercariae were also concentrated in the brain and eyes of Z. temminckii. Therefore, we hypothesize that the parasite could control the behavior of the fish. Hence, in this study we performed cercarial artificial infection experiments in order to investigate this hypothesis in detail in the laboratory. Both uninfected Z. teminckii (mean length = 6.61 ± 0.51 cm; mean weight = 2.58 ± 0.63 g) and naturally shed cercariae (n=200) from Semisulcospira were kept together in 1-L glass container with 400 ml of aged tapwater (24±2 0C) at different time intervals for a certain period of time. Results revealed that 44% of C. armatus cercariae could infect Z. teminckii within five minutes and gradually increased until one hour with mean infection rate of 85%. Metacercariae first appeared in the fish brain at six hours post-infection and their numbers gradually increased until 24 hours. Cyst formation has been completed at seven days post-infection. Since our infection study is still in progress, we will present in this meeting the data that will be obtained throughout the experiment.