(a) ミトコンドリア型チトクロムｃ酸化酵素 のヘムー銅複核中心における構造を明らかにするために、一酸化炭素、アザイド、シアンをプローブとして赤外分光法、EPR法により精密な解析を行い、複核中心へのこれら呼吸阻害剤の結合様式を明らかにした[31, 33, 34]。特に、アザイド、シアンが複核中心において架橋型配位子として存在していることを明らかにし、金属中心の部分還元に伴い、その結合様式が変化することを明らかにした。

　(b) ミトコンドリア型チトクロムｃ酸化酵素と同じヘムー銅末端酸化酵素ファミリーに属し、大腸菌・酢酸菌細胞膜に存在するbo, ba型ユビキノール酸化酵素を精製し、赤外分光法、EPR法等による複核中心の構造解析を行った[35, 45, 49, 51, 57]。ユビキノール酸化酵素はヘムー銅末端酸化酵素を研究する上で非常に良いモデルとなることを示した[35]。

　(c) 生体膜中に存在し生体エネルギー変換において重要な位置を占めるヘムー銅末端酸化酵素の持つプロトンポンプ機構を明らかにするため、大腸菌 bo型ユビキノール酸化酵素の部位特異的変異体を作製し、赤外分光、共鳴ラマン散乱、EPR法による解析を行い、ヘムー銅末端酸化酵素活性中心付近の構造モデルを提出した[38, 41, 48, 52, 54]。

　(a) ヘムー銅末端酸化酵素とは機能・構造上異なるが、呼吸鎖末端酸化酵素であるシトクロムbd型ユビキノール酸化酵素を大腸菌細胞膜から精製し、生物物理的手法により解析した。一酸化炭素結合型酵素が通常のヘムタンパク質とは非常に異なった性質（高いC-O伸縮振動数、低いFe²⁺-CO伸縮振動数）を持っていることを明らかにし、精製酵素が実際には酸素結合型酵素であることを一酸化窒素との置換により明らかにした[37]。

　(b)精製酵素のヘム含量、分光解析とシアン、アザイド結合型酵素の赤外分光測定により、活性中心が２つのヘムよりなるユニークな複核中心を形成していることを初めて明らかにした[44, 58, 59]。

　(c)一酸化窒素(NO)結合型酵素のEPRスペクトル解析により、複核活性中心において、酸素分子が結合するヘムdの第５配位子は窒素原子であることを初めて明らかにした[46]。

(5) 神経内分泌小胞膜におけるシトクロムb₅₆₁, PAMを中心とする電子伝達系の解析

　(a) 神経伝達物質(ノルアドレナリン・アドレナリンなどの生体アミン、アミド化神経ペプチド)の貯蔵と放出に携わっている神経内分泌小胞には膜貫通型シトクロムb₅₆₁が存在し、細胞質アスコルビン酸から小胞内モノオキシゲナーゼ（ドーパミン-β水酸化酵素・ペプチジルグリシンアミド化酵素(PAM)）への電子伝達を行っている。この電子伝達はこれら神経伝達物質の合成に必須である。シトクロムb₅₆₁を高純度に精製する方法を確立し、１分子中に２個のヘムＢが結合していることを見出した[50]。

　(b) 各種動物のシトクロムb₅₆₁ cDNA クローニングよりアミノ酸配列を明らかにし、アスコルビン酸・セミデヒドロアスコルビン酸結合部位と思われる２つの保存領域が細胞質側、小胞膜内側にそれぞれ存在すること、また２つのヘムの結合部位も保存領域近くに存在する事を提唱した[55]。

　(c) それぞれのヘムBがアスコルビン酸・セミデヒドロアスコルビン酸との電子伝達反応において、電子受容、電子供与という特異的役割を持つことをパルスラジオリシス法により解明した[56]。

　(d) DEPCによる特異的化学修飾によりそれぞれの反応を特異的に阻害できることを明らかにし、その阻害部位をMALDI-TOF-MS法により特定した[60]。さらにDEPCによる阻害がアスコルビン酸の存在で阻止できることからチトクロム b561上に生理的アスコルビン酸結合部位が存在することを明らかにした[62]。

　(e) 扁形動物プラナリアでのシトクロムb₅₆₁とPAMの神経特異的発現をcDNAクローニング、in situ hybridization、組織免疫染色等により解析した[65]。

　(f) 精製したウシシトクロムb₅₆₁のNH₂末端付近のペプチドを詳細に解析した結果、末端のMet残基がアセチル化されていることを明らかにした。しかし、以前に提唱されていた脂肪酸による翻訳後修飾は存在しないことがわかった[66]。

　(g) 精製・可溶化した酸化型シトクロムb₅₆₁へのAsAからの電子伝達反応をstopped-flow法により解析した。ヘムの還元反応曲線は最小でも4つの指数関数の和でなければ近似できなかった。これは電子がAsAから細胞質側ヘムへ渡り、さらに小胞内側ヘムへ渡る正規の経路の他に、細胞質側ヘムへ渡る別の経路やAsAから小胞内側ヘムへ直接渡る経路があることの反映と考えられる。酸化型標品をDEPC処理すると、細胞質側ヘムに配位したHis残基等が修飾され、AsAから細胞質側ヘムへの電子伝達が阻害される。DEPC処理時にAsAを共存させると、His残基の修飾は阻害され、Lys85残基のみが修飾される。この標品では、最も速いフェイズは、未処理標品の最も速いフェイズと比べると非常に遅いことからLys85残基はAsAとの結合において重要な役割をすると考えられる。また、低いpHでは未処理標品とAsAとの反応初期において顕著なラグが生じることがわかった。低いpHではシトクロムb₅₆₁の基質結合部位に構造変化が起こり、b₅₆₁-AsA複合体が生成され難くなる等の理由が考えられる[67]。

　(h) 精製・可溶化したシトクロムb₅₆₁を還元状態でリポソーム膜中に再構成すると、内腔中に封入したAsAに由来する膜貫通電子伝達反応が起こることがわかった。これは小胞外に添加した酸化型シトクロムcのヘムが還元されることから証明された。この還元反応は、前もって酸化型シトクロムb₅₆₁をDEPC処理しておくと顕著に阻害されることがわかった。さらに小胞外に水溶性ドーパミンβ水酸化酵素を添加することによって、チラミン水酸化反応によるオクトパミンの生成反応をサポートできることもわかった。シトクロムb₅₆₁はリポソーム膜中にクロマフィン小胞での向きとは逆に入っていることがトリプシン処理断片のSDS-PAGEとMALDI-TOF-MS解析の結果明らかとなった[68]。

　(i) 我々はすでにシトクロムb₅₆₁ １分子中には2つのヘムb中心が存在しており、完全酸化型では２種の異なったlow-spin種(g_z=3.13とg_z=3.69)がEPR測定により観測されることがわかっている。今回行った共鳴ラマン解析では酸化型、還元型ともに6配位型low-spin状態をとっていることがわかった。またEPR解析により、酸化型でDEPC処理したb₅₆₁では細胞質側に位置すると思われるg_z=3.69のヘム種がAsAでは還元できない形に変わることがわかった。しかし、小胞内側に位置すると思われるg_z=3.13種については何の影響も無かった[69]。

Fig. 2 　ウシcytochrome b561の膜貫通型構造モデル 　膜を貫通しているα-ヘリックス部分はNH2末端側より順番にへリックス1、2と名づけた。 全ての生物種で完全に保存されている2つの配列、および、5個のHis残基、1個のMet残基、保存性の良い1個のHis残基を示し、また保存性の良い塩基性アミノ酸残基を＋印で表した。

Fig. 3 プラナリアcytochrome b561-mRNAの神経系に沿った分布 (In situ hybridizaion) (A) 背中側　(B) 腹側

Fig. 4 プラナリアcytochrome b561タンパク質の神経系に沿った発現分布（抗プラナリアb561抗体による染色） (C) Western blotting　(D) 背中側　(E) 腹側

Fig.5 プラナリアの目と脳におけるcytovhrome b561とPHM（PAMのmonooxygenase domainに相当）の発現 上：目　右：脳と目 核をHoechst 33342で染色。arrestin（目の特異的マーカー）とb561は特異的抗体で染色。PHMはin situ hybridizationにより染色。